β-葡聚糖酶純化、性質(zhì)及編碼基因

10.2.2.1 β-葡聚糖酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)

葡聚糖酶按照水解支鏈的類型分為a-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶。a-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶按照作用的糖苷鍵類型的不同，又可分為β（或a）-1，2葡聚糖酶，β（或a）-1，3葡聚糖酶，β（或a）-1，4葡聚糖酶和β（或a）-1，6葡聚糖酶。β-葡聚糖酶屬于水解酶類，按照水解的作用方式（水解發(fā)生在胞外或是胞內(nèi)）可以分為內(nèi)切β-葡聚糖酶和外切β-葡聚糖酶兩種類型。β-葡聚糖酶活性能力是根據(jù)水解最后的產(chǎn)物是單聚體還是二聚體而定義的。內(nèi)切β-葡聚糖酶的活性通常比外切β-葡聚糖酶的活性要高一些，并且內(nèi)切β-葡聚糖酶形成的低聚糖要多于外切β-葡聚糖酶。對β-葡聚糖酶尤其是β-1，3葡聚糖酶有較多的文獻(xiàn)報(bào)道，β-1，6葡聚糖酶在微生物中很少被發(fā)現(xiàn)。大部分的外切葡聚糖酶表現(xiàn)有β-1，3葡聚糖酶和β-1，6葡聚糖酶的活性（Yamamoto et al.，1975；Vazquez de Aldana et al.，1991）。

木霉和粘帚霉的β-葡聚糖酶包括內(nèi)切β-葡聚糖酶和外切β-葡聚糖酶。由于每種酶都有不同的成分、性質(zhì)和Mr值，阻礙了這些酶之間的協(xié)同作用和調(diào)節(jié)作用（表10.2）。因?yàn)槊杆械牟煌煞质莵碓从诓煌木?，所以不能確定這些不同的酶是不同基因的產(chǎn)物還是基因在翻譯之后修飾的產(chǎn)物。因?yàn)楫a(chǎn)酶條件的不同，所以估算Mr值也有很多不同的方法。試驗(yàn)顯示哈茨木霉CECT內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶與內(nèi)切β-1，6葡聚糖酶的抗體與其他木霉菌株產(chǎn)生的β-葡聚糖酶會發(fā)生凝集作用（Rey et al.，2001），表明木霉中至少存在這兩種酶。不同的β-葡聚糖酶編碼基因的分離是確定木霉產(chǎn)生多少種β-葡聚糖酶的前提條件。

大部分研究采用色譜分析技術(shù)來提純β-葡聚糖酶。Dubordieu等（1985）從哈茨木霉的商品化酶制劑中分離到兩個(gè)外切β-1，3葡聚糖酶、1個(gè)內(nèi)切β-1，6葡聚糖酶和1個(gè)β-葡聚糖酶單體。在這兩個(gè)外切β-1，3葡聚糖酶中，一個(gè)酶的酶活性主要是由分子量大小為40kDa的蛋白構(gòu)成的，此酶能降解灰霉病的β-1，3 葡聚糖和β-1，6葡聚糖。利用色譜分析法也從鉤狀木霉粗提物中分餾到了兩種酶，一種是淀粉葡萄糖苷酶，無葡聚糖酶活性，一種是β-葡聚糖酶，沒有淀粉葡萄糖苷酶活性。β-葡聚糖酶是由兩個(gè)外切β-1，3葡聚糖酶和一個(gè)內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶組成的，它們的等電點(diǎn)pI分別為5.25，4.95和4.20（Thomas et al.，1983）。1977年，Bielecki和Galas從鉤狀木霉的另一個(gè)商品化制劑（名叫“Onozuka”）中分離純化出兩個(gè)β-1，3葡聚糖酶：一個(gè)是酸性但沒有裂解細(xì)胞壁活性的水解海帶多糖（β-1，3 葡聚糖），另一個(gè)對釀酒酵母有細(xì)胞壁裂解活性（Bielecki et al.，1977）。De Vies和Wessels（1973）從一株寄生在真菌中的綠色木霉里分離純化出一種外切β-1，3葡聚糖酶，但是文章里僅僅描述了這個(gè)酶產(chǎn)生原生質(zhì)體的能力。Tang-arone等（1989）比較了雙孢菇糖提取物里長枝木霉產(chǎn)生的兩種不同的β-葡聚糖酶。研究人員將從鉤狀木霉中分離的海帶多糖稀釋80倍后，發(fā)現(xiàn)其Km值低于擔(dān)子菌細(xì)胞壁產(chǎn)生的β-葡聚糖酶的Km值，認(rèn)為海帶多糖中葡聚糖酶的作用影響器官的形成（Griffin，1994）。

近年來研究最多的是哈茨木霉CECT2413在真菌寄生物中產(chǎn)生的β-葡聚糖酶。大部分研究是采用等電法從哈茨木霉中分離一種基本同工酶和至少三種酸性同工酶（De la Cruz et al.，1995b）。通常說的β-1，3葡聚糖酶BGN13.1是以石耳多糖為介質(zhì)采用吸附法純化得到的純物質(zhì)。BGN13.1的分子量是78kDa且不能被糖化。這種酶在釀酒酵母細(xì)胞壁和海帶多糖細(xì)胞壁中表現(xiàn)出最大的酶活性（海帶多糖的Km值是3.3mg/mL）。這個(gè)酶屬于內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶。BGN13.1 這個(gè)酶只對木霉具有專一性，因?yàn)榭寡宸磻?yīng)表明：這個(gè)酶與從真菌和植物中提取的β-葡聚糖酶沒有發(fā)生交叉反應(yīng)。同樣的，這個(gè)酶與從哈茨木霉中提取的β-1，3葡聚糖酶也不發(fā)生抗血清反應(yīng)。哈茨木霉CECT2413至少產(chǎn)生兩種內(nèi)切 β-1，6 葡聚糖酶，純化后大小分別為51kDa和43kDa（De la Cruz et al.，1995b）。還有研究將一些木霉（綠色木霉、長枝木霉、里氏木霉、康寧木霉、綠木霉）的培養(yǎng)物采用Western進(jìn)行雜交，雜交結(jié)果表明這些木霉在相同條件下都產(chǎn)生BGN16.2（Rey et al.，2001）。

從哈茨木霉培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)的多種葡聚糖酶具有不同的催化活性、分子量和基因特性。但是對這些酶是由單基因調(diào)控還是由多基因調(diào)控目前仍不確定。Noronha等（1996）發(fā)現(xiàn)了另一株哈茨木霉在寄生真菌細(xì)胞壁或在幾丁質(zhì)平板上培養(yǎng)時(shí)均產(chǎn)生β-1，3葡聚糖酶。從這株哈茨木霉中純化到一個(gè)酸性的內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶，分子量是36kDa，對海帶多糖有水解活性。其他研究者描述哈茨木霉能產(chǎn)生兩個(gè)分子量為32kDa和78kDa的外切β-1，3葡聚糖酶（Kitamoto et al.，1993；Lorito et al.，1994），也有人從一株里氏木霉（Bamforth，1980）中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)外切β-1，3 葡聚糖酶，分子量為70kDa。從哈茨木霉和里氏木霉中發(fā)現(xiàn)的這些β-1，3葡聚糖酶大多是外切酶，水解通常發(fā)生在β-1，3位置，很少發(fā)生在β-1，6位置。從哈茨木霉CECT2413 中克隆到兩個(gè)葡聚糖酶基因；一個(gè)是內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶，基因編碼的蛋白質(zhì)大小為78kDa（表10.2）；另一個(gè)是內(nèi)切β-1，6葡聚糖酶，基因編碼的蛋白質(zhì)大小為43kDa。β-1，3葡聚糖酶基因的克隆表明了木霉菌株CECT2413主要具有β-1，3葡聚糖酶活性。該基因的克隆通過檢測純化蛋白的氨基酸序列得到。Southern雜交表明哈茨木霉β-1，3葡聚糖酶基因都是bgn13.1的單拷貝，哈茨木霉基因所編碼的蛋白由728個(gè)氨基酸組成，優(yōu)于N端的34個(gè)早前體氨基酸序列，該蛋白序列被一個(gè)KEX2肽酶分開，然后終止于KR（De la Cruz et al.，1995b）。在酵母里表達(dá)時(shí)，這個(gè)早前體氨基酸序列才被合成和分泌（Lora et al.，1995）。將早前體氨基酸序列和其他的β-葡聚糖酶進(jìn)行氨基酸序列同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原先假定的活性部位能夠識別谷氨酸。但是沒有證據(jù)表明這個(gè)連接酶的分離同纖維素酶和葡聚糖酶一樣。在煙草Ⅰ類幾丁質(zhì)酶中，帶有半胱氨酸的N末端對幾丁質(zhì)的連接位點(diǎn)很重要，N末端的側(cè)鏈?zhǔn)?～10 bp長度的非完全正向重復(fù)序列。以上表明這些區(qū)域來自一個(gè)普通的原始基因且是經(jīng)過轉(zhuǎn)化得到的（Shinshi et al.，1990）。通過放線菌的水平基因交換法明確了黃色粘球菌基因的結(jié)合位點(diǎn)和催化位點(diǎn)，這一方法被證明可行（Quillet，1995）。一些葡聚糖酶結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座源可以解釋在一些菌中葡聚糖酶基因缺失的原因，例如木霉中β-葡聚糖酶基因的缺失。

將bgn13.1基因的序列與a或β-葡聚糖酶的基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同源性很低。因此確定這個(gè)基因編碼的蛋白代表了一類新的β-1，3葡聚糖酶。來源于細(xì)菌、酵母、絲狀真菌和植物的bgnl3.1線性序列的保守區(qū)域不同于其他來源的bgn13.1（De la Cruz et al.，1995b）。但是用玉米葉斑病的β-1，3葡聚糖酶基因就能檢測到限制性同源性。這也可以從60余個(gè)葡聚糖酶基因的系統(tǒng)發(fā)育樹上看出限制性同源性。從一些文獻(xiàn)中也可以看出由 bgn13.1 形成的外群體和其他的 β-葡聚糖酶編碼基因（Barnett et al.，1991）或β-1，6葡聚糖酶編碼基因（De la Cruz et al.，1995b）在親緣關(guān)系上比較遠(yuǎn)。但是由bgn13.1形成的外群體和木霉纖維素酶的親緣關(guān)系比較近（表10.1）。

表10.2 從木霉中純化的葡聚糖酶性質(zhì)

注：a為mg/mL；b為μmol葡萄糖/（min.mg蛋白質(zhì)）；ND為未描述；Gn為葡萄糖鏈的長度。

哈茨木霉CECT 2413的胰蛋白酶純化后，根據(jù)其氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物克隆了β-1，6葡聚糖酶的編碼基因。相反的，對哈茨木霉bgn13.1基因，Southern 雜交分析的結(jié)果表明存在3個(gè)相同的基因拷貝（Lora et al.，1995）。蛋白序列分析表明來自釀酒酵母（Muthukumar et al.，1993；San Segundo et al.，1993）的EXG1（分布在耐熱分生孢子里的外切β-1，3葡聚糖酶）和念珠菌的 SPR1（外切 β-1，3葡聚糖酶）有部分同源性（Chambers et al.，1993）。檢測其蛋白序列的保守區(qū)域，發(fā)現(xiàn)外切葡聚糖酶催化區(qū)域的來源和內(nèi)切β-葡聚糖酶的來源一樣，且推測蛋白序列中含有糖基化基團(tuán)。但是比較經(jīng)En-doH處理后的蛋白Mr值和經(jīng) SDS-PAGE電泳后的蛋白遷移帶值，發(fā)現(xiàn)從哈茨木霉CECT2413中純化的第二個(gè)內(nèi)切β-1，6葡聚糖酶內(nèi)切肽序列幾乎沒有糖基化基團(tuán)（De la Cruz et al.，1995a）。高雯等（2008）在哈茨木霉LTR-2中克隆出了內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶基因glu。該基因由2289個(gè)核苷酸殘基組成，含有一個(gè)開放閱讀框架，可以編碼762個(gè)氨基酸，翻譯后的氨基酸序列含有兩個(gè) β-1，3葡聚糖酶的保守區(qū) RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF。該基因與已發(fā)表的木霉β-1，3葡聚糖酶基因有較高的同源性，其中與哈茨木霉bgn3.1和綠木霉bgn13.1的同源性均達(dá)到93%以上。該序列已經(jīng)提交GenBank，登錄號為EF176582。表10.3列出了目前已克隆的木霉菌葡聚糖酶基因。

10.2.2.2 β-葡聚糖酶的調(diào)控和功能

和其他的一些絲狀真菌一樣（Griffin，1994），木霉和粘帚霉（De la Cruz et al.，1993）也是通過誘導(dǎo)和代謝產(chǎn)生β-葡聚糖酶。問題是像β-1，3葡聚糖這樣的大分子是如何被催化和誘導(dǎo)的，答案仍然是未知的。人們根據(jù)生化和分子生物學(xué)方法對纖維素系統(tǒng)中酶的誘導(dǎo)和催化進(jìn)行了推測，這兩種方法一直認(rèn)為是附著分生孢子的外切葡聚糖酶首先攻擊了β-1，3葡聚糖分子（Kubicek et al.，1987 a；Kubicek et al.，1993）。菌絲體釋放的二糖進(jìn)一步促進(jìn)了葡聚糖酶的生物合成。生長在不同碳源中的綠木霉或生長在寄主細(xì)胞壁中的粘綠木霉的培養(yǎng)基上清液中都有β-葡聚糖酶活性、幾丁質(zhì)酶活性、脂肪酶活性和蛋白酶活性。幾丁質(zhì)也能誘導(dǎo)長枝木霉（Tangarone et al.，1989）和玉米葉斑病菌（Schaeffer et al.，1994）產(chǎn)生β-1，3葡聚糖酶。

在自然界中真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶經(jīng)常同時(shí)產(chǎn)生，同時(shí)誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的底物，而單個(gè)酶單獨(dú)出現(xiàn)的情況并不多見（Lorito et al.，1994；表10.4）。酶對底物的相對活性是多種多樣的，但是β-葡聚糖酶的最高活性是在寄主細(xì)胞壁中生長時(shí)產(chǎn)生的（Van Tilbura et al.，1993）。培養(yǎng)了8d的樣品做SDS-PAGE電泳，分析電泳結(jié)果表明胞外蛋白的出現(xiàn)原因是誘導(dǎo)機(jī)制，蛋白的失活、降解和所檢測到的酶活都是由于不同活性的酶在不同的作用時(shí)間誘導(dǎo)的結(jié)果（Van Tilbura et al.，1993）。在另外一些真菌中，酶失活的機(jī)理是由于內(nèi)源蛋白的合成導(dǎo)致蛋白酶解和糖組成的轉(zhuǎn)移（Friebi et al.，1975；Santos et al.，1978b）。不同的酶被不同的真菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)后被發(fā)現(xiàn)和木霉的寄生能力相關(guān)（Sivan et al.，1989）。然而Ridout等（1986）發(fā)現(xiàn)生長在離體細(xì)胞壁中的蛋白屬性不同于在植物病原真菌產(chǎn)生拮抗作用時(shí)產(chǎn)生的蛋白。

表10.3 已克隆的木霉菌葡聚糖酶基因

注：NCBI表示此行為從該網(wǎng)站獲取數(shù)據(jù)。

表10.4 哈茨木霉CECT2413在不同碳源培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的水解酶活性

注：C.W.為細(xì)胞壁；B.c為灰葡萄孢菌；P.c為馬鈴薯晚疫病；R.s為立枯絲核菌；T.h為哈茨木霉。

（De la Cruz，et al.，1993）

對一些重要的β-葡聚糖酶已經(jīng)研究的很詳細(xì)。De la Cruz等（1993，1995b）發(fā)現(xiàn)哈茨木酶CECT2413在不同的碳源上被幾丁質(zhì)、黑曲霉多糖（a-1，3和a-1，4葡聚糖）、石耳多糖（β-1，6葡聚糖）、真菌細(xì)胞壁、葡萄糖脅迫等條件誘導(dǎo)以后能產(chǎn)生外切β-1，3葡聚糖酶和外切β-1，6葡聚糖酶（表10.4）。無論是RNA干擾還是蛋白質(zhì)合成抑制酶的誘導(dǎo)，都離不開酶合成中的表達(dá)和調(diào)控。在很多菌株中（長枝木霉、綠色木霉、康寧木霉、里氏木霉和粘綠木霉）觀察到酶相似的表達(dá)和調(diào)控。在大多數(shù)情況下，當(dāng)有2%葡萄糖存在的條件下一般能觀察到β-葡聚糖酶的活性（Rey et al.，2001）（表10.5）。

表10.5 在不同碳源條件下木霉產(chǎn)生的β-1，6葡聚糖酶的活性

注：Bot.為灰霉；P.spp為青霉；P.c.為馬鈴薯晚疫??；S.c.為釀酒酵母；C.W.為細(xì)胞壁。

（Rey et al.，2001）

然而，當(dāng)不同的β-葡聚糖酶同工酶被單獨(dú)研究的時(shí)候就獲得了一組不同的調(diào)控模式（De la Cruz et al.，1995b）。在幾丁質(zhì)、海帶多糖、石耳多糖存在的條件下檢測到四個(gè)同工酶，它們都是在真菌細(xì)胞壁胞外產(chǎn)生的內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶。BGN13.1的轉(zhuǎn)錄是由內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶基因編碼得到，而并非葡萄糖脅迫產(chǎn)生。在有2%葡萄糖存在的條件下能檢測到BGN13.1的活性（表10.6）。當(dāng)在真菌細(xì)胞壁中生長時(shí)，雖然這個(gè)內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶單獨(dú)存在時(shí)不能產(chǎn)生透明水解圈，但是它能阻止病原真菌和其他的水解酶相結(jié)合。因?yàn)檫@個(gè)內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶的特殊誘導(dǎo)作用和裂解活性，這個(gè)酶被認(rèn)為是木霉對抗一些病原真菌的拮抗酶，然而它在腐生植物里的作用還沒有被發(fā)現(xiàn)（De la Cruz et al.，1995b）。

表10.6 哈茨木霉CECT2413產(chǎn)生的兩種β-葡聚糖酶和兩種幾丁質(zhì)酶在不同底物條件下的不同調(diào)控作用

注：N 為northern雜交實(shí)驗(yàn)；W為western雜交實(shí)驗(yàn)；A為凝膠活性；R.s.為R.solani；S.c.為S.cerevisiae；C.W.為細(xì)胞壁；ND為未做。

（De la Cruz et al.，1995b；Gelgado et al.，2000；Gelgado et al.，2002）

在有葡萄糖存在的條件下，哈茨木霉CECT2413的內(nèi)切β-1，6 葡聚糖酶編碼基因可誘導(dǎo)細(xì)胞壁產(chǎn)生聚合物，從這個(gè)內(nèi)切β-1，6葡聚糖酶的8000個(gè)基因里僅獲得了一個(gè)cD-NA基因，且mRNA的翻譯水平很低，說明該基因的表達(dá)很微弱（表10.6）。當(dāng)內(nèi)切β-1，6葡聚糖II濃度較高時(shí)（當(dāng)濃度為25mg/mL時(shí)，抑制率為70%～80%），將它放在酵母細(xì)胞壁中培養(yǎng)，此酶能產(chǎn)生透明圈，而且這個(gè)酶能阻止其他真菌與其他裂解酶的結(jié)合（De la Cruz et al.，1995a）。

β-葡聚糖酶的調(diào)控規(guī)則如上所述，一些學(xué)者也研究了β-葡聚糖酶的構(gòu)成。Del Rey等（1979）將綠木霉在葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用破壁提取法獲得了β-1，3葡聚糖酶和β-1，6葡聚糖酶。如果不破除細(xì)胞壁，要么不能產(chǎn)生β-葡聚糖酶，要么就是β-1，6葡聚糖酶的產(chǎn)量很低。作者認(rèn)為這種現(xiàn)象表明這些β-1，6 葡聚糖酶和形態(tài)基因有關(guān)。Kubicek（1982）也支持上述觀點(diǎn)，他描述了擬康氏木霉和黃綠木霉β-1，3葡聚糖酶的構(gòu)成。β-1，3葡聚糖酶的活性和培養(yǎng)基β-葡聚糖酶的釋放量有關(guān)。這表明β-1，3葡聚糖酶的形成與β-葡萄糖和β-葡聚糖酶之間的轉(zhuǎn)換有關(guān)。然而，在擬康氏木霉中和細(xì)胞壁結(jié)合的β-葡聚糖酶活性主要是由3種同工酶決定的，但是這三種酶的作用是相同的還是各不相同的至今尚不明確（Kubicek，1982）。在青霉菌中，與細(xì)胞壁結(jié)合的β-1，3葡聚糖酶Ⅱ和Ⅲ的作用是促進(jìn)細(xì)胞壁的生長和延伸，而β-1，3葡聚糖酶I的作用是促進(jìn)葡聚糖的流動和分生孢子的形成（Santos et al.，1978a，b）。綜上所述，酶與細(xì)胞壁的結(jié)合對形態(tài)基因的建成并非是必需的。里氏木霉細(xì)胞壁和血漿膜的最外層是β-葡聚糖酶，但是它的作用是水解纖維素（Cummings et al.，1996）。

真菌的β-葡聚糖酶有各種不同的作用，包括營養(yǎng)（表10.7）和抑真菌作用。哈茨木霉P1產(chǎn)的78kDa的β-1，3葡聚糖酶有抑真菌活性，它能幫助內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)-β-1，4殼聚糖酶阻止灰霉病孢子的萌發(fā)和萌發(fā)管的延長。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度是10～20μg/mL時(shí)能徹底地抑制病原菌的孢子萌發(fā)和萌發(fā)管的延長。Clarkson（1992）描述了哈茨木霉β-1，3葡聚糖酶的抑菌作用。另外，從綠木霉中分離的β-1，3葡聚糖酶和β-1，4葡聚糖酶能破壞真菌細(xì)胞壁的完整并導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)滲漏（Jeffries et al.，1994）。

表10.7 不同的木霉和病原菌在雙重培養(yǎng)基上對峙培養(yǎng)的β-1，3和β-1，6葡聚糖酶活性

注：+為致病菌培養(yǎng)1～4d過度生長或死亡；±為培養(yǎng)4～10d；-為培養(yǎng)10d后病原菌不生長或不死亡。

（Rey et al.，2001）

β-葡聚糖酶是木霉和粘帚霉細(xì)胞壁的組分之一，如同葡聚糖裂解酶的作用一樣（De la Cruz et al.，1993，1995b）。目前仍不是很清楚它們的細(xì)胞壁是如何克服裂解酶的作用的。有一種解釋認(rèn)為是酵母成分對外界失活而造成的（Adans et al.，1993；Manocha et al.，1988）。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組分的出現(xiàn)抑制了裂解酶。例如，a-葡聚糖鏈的可折疊性質(zhì)使它能抵制裂解酶（Kuhn et al.，1990）。其他成分例如結(jié)構(gòu)蛋白也能起到保護(hù)作用。Goldman等（1994）和Vasseur等（1995）分離了3個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)，分子量大小分別為69kDa，37kDa和15.6kDa。假定15.6kDa蛋白的氨基酸序列在絲氨酸和丙氨酸的結(jié)構(gòu)蛋白里也有，那么就證明該葡聚糖能夠抑制水解酶。另外，黑色素的出現(xiàn)也為裂解酶提供了保護(hù)（Bull，1970）。

許多β-葡聚糖酶和真菌的自溶有關(guān)系。但是這些酶的重要作用還沒有完全被弄清楚。例如在細(xì)胞壁組分更新中的作用、細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏條件下的生存、與殺菌劑相互作用干擾細(xì)胞壁的合成等方面。一些絲狀真菌在碳源受限的條件下形態(tài)基因發(fā)生改變，同時(shí)β-葡聚糖酶的一些裂解酶迅速增加都被認(rèn)為是為β-葡聚糖酶提供能量。在一般的生長過程中，β-1，3葡聚糖酶和β-1，6葡聚糖酶在菌體自溶和細(xì)胞壁延伸時(shí)充當(dāng)結(jié)構(gòu)葡聚糖的角色（Santos et al.，1977，1978a，b）。

腸內(nèi)營養(yǎng)時(shí)間

1、氨基酸型 ： ①平衡型:般營養(yǎng)型,商品名制劑腸內(nèi)營養(yǎng)粉aa（維沃）；②疾病適用型:例苯丙氨酸代謝障礙適用等每袋80g內(nèi)含100%游離氨基酸濃度約15%、脂肪2.5%（脂肪0.8g亞油酸0.6g）碳水化合物82.2%(61.7g麥芽糖糊精食物淀粉)同含體必需礦物質(zhì)、種維素微量元素等屬于渣糞便排量少需消化液或極少消化液便吸收能源自糊精及食物淀粉熱量與氮比值128:1；脂肪自豆油其含量控制需要量低限減少胰腺外泌系統(tǒng)腸管泌刺激

適用于消化道通暢患者能進(jìn)食合并-重度營養(yǎng)足；消化道術(shù)前準(zhǔn)備；消化道手術(shù)吻合口瘺：咽部瘺、食管瘺、胃瘺、結(jié)腸瘺等；胰腺炎恢復(fù)期；短腸綜合征患者（腸度短于60cm）；炎性腸道疾患：克羅恩病等

2.短肽型腸內(nèi)營養(yǎng)（包括：乳劑、混懸液、粉劑）類制劑商品名腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液（sp）（百普力）、及粉劑類型（百普素）等所含蛋白質(zhì)蛋白水解物腸運(yùn)輸?shù)途垭捏w系低聚肽經(jīng)腸粘膜刷狀緣肽酶水解進(jìn)入血液容易機(jī)體利用同含乳糖避免乳糖耐受引起腹瀉脂代謝障礙等系列問題幾乎完全吸收低渣需少量消化液吸收排糞便量少適用于胃腸道功能或部胃腸道功能患者：胰腺炎；腸道炎性疾病；放射性腸炎化療；腸瘺；短腸綜合征；艾滋病病毒染等作營養(yǎng)足病手術(shù)前喂養(yǎng)及腸道準(zhǔn)備能補(bǔ)充體理功能所需能量及營養(yǎng)

3．整蛋白型（劑型：乳劑、混懸液、粉劑）類制劑容易混淆要按照標(biāo)準(zhǔn)類仍容易理解

（1）平衡型普通整蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)：見商品名腸內(nèi)營養(yǎng)制劑tp（安素）、腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑tp（瑞素）等該型制劑進(jìn)入胃腸道刺激消化腺體泌消化液幫助消化、吸收體內(nèi)消化吸收程同食物提供體必需營養(yǎng)物質(zhì)能量需要其些制劑含鏈三酰甘油（瑞素）更利于脂肪代謝吸收；些制劑節(jié)約入液量制高能量密度每1ml提供1.3-1.5kcal能量（腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（tp-he）（瑞高）腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液（tpf）（能全力1.5））些制劑添加膳食纖維改善胃腸道功能（腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（tpf-d）（瑞代）能全力、瑞先等）同制劑產(chǎn)品特色同屬于同類型要解其特殊處錯類制劑適于面或頸部創(chuàng)傷或顱頸部手術(shù)；咀嚼吞咽功能性或神經(jīng)性損害或咽困難；意識喪失病/或接受機(jī)械通氣??；及高解代謝狀態(tài)癌癥、燒傷顱腦創(chuàng)傷??；神經(jīng)性畏食等

（2）疾病適用型整蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)：糖尿病型腸內(nèi)營養(yǎng)制劑（腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（tpf-d）瑞代）、腫瘤適用型腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（tpf-t）（瑞能））、高蛋白、高能量腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（瑞高、瑞先）、免疫增強(qiáng)型腸內(nèi)營養(yǎng)（茚沛）、肺病型腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液（易菲佳）、腎病用復(fù)a-酮酸類似物（同）等

二、en禁忌癥及注意事項(xiàng)

en萬能臨床治療些情況適合用en能應(yīng)用于完全腸梗阻嚴(yán)重短腸綜合征或高排泄量瘺半乳糖血癥患者嚴(yán)重腹腔內(nèi)染者禁用并且嚴(yán)格禁忌靜脈內(nèi)輸入en

使用en應(yīng)注意定期監(jiān)測化指標(biāo)使用前搖勻效期內(nèi)使用藥品應(yīng)25℃密閉保存啟冰箱內(nèi)(2 – 10℃)保存并于24h內(nèi)用完

三、早期應(yīng)用en醫(yī)發(fā)展趨勢

患者食欲、飲食降應(yīng)早期考慮給予腸內(nèi)營養(yǎng)支持預(yù)防營養(yǎng)足并疾病康復(fù)定幫助

1、給藥途徑根據(jù)患者情況選擇：口服、鼻飼、胃造瘺、空腸造口等

2、給藥均通患者胃腸道耐受情況由少量逐漸增至患者需要量

3、喂養(yǎng)管材料選擇目前首選聚氨酯導(dǎo)管較管柔軟患者耐受性導(dǎo)管ph敏聚氯乙烯導(dǎo)管含增塑劑較硬、ph敏易現(xiàn)咽炎病耐受性使用間短硅膠材質(zhì)導(dǎo)管柔軟操作易置入另外管壁內(nèi)粗糙故易發(fā)堵塞

總使用en治療患者及家屬應(yīng)該定宣教使解en重要性掌握般護(hù)理知識效預(yù)防并發(fā)癥發(fā)

什么是EN制劑營養(yǎng)基質(zhì)

一、EN制劑類型與適應(yīng)證

1、氨基酸型 分為： ①平衡型:一般營養(yǎng)型,商品名制劑有腸內(nèi)營養(yǎng)粉AA（維沃）；②疾病適用型:例如苯丙氨酸代謝障礙適用等。每袋80g，內(nèi)含100%的游離氨基酸濃度約15%、脂肪為2.5%（脂肪0.8g，亞油酸0.6g），碳水化合物為82.2%(61.7g為麥芽糖糊精，食物淀粉)，同時(shí)含有人體必需礦物質(zhì)、多種維生素和微量元素等。屬于無渣，糞便排出量少，因此不需消化液或極少消化液便可吸收。能源來自糊精及食物淀粉，熱量與氮的比值為128:1；脂肪來自大豆油，其含量控制在需要量的最低限，以減少對胰腺外分泌系統(tǒng)和腸管分泌的刺激。

適用于消化道通暢的患者，不能正常進(jìn)食，合并中-重度營養(yǎng)不足；消化道術(shù)前準(zhǔn)備；消化道手術(shù)后吻合口瘺如：咽部瘺、食管瘺、胃瘺、結(jié)腸瘺等；胰腺炎的恢復(fù)期；短腸綜合征的患者（小腸的長度短于60cm）；炎性腸道疾患如：克羅恩病等。

2.短肽型腸內(nèi)營養(yǎng)（包括：乳劑、混懸液、粉劑）此類制劑商品名有腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液（SP）（百普力）、以及粉劑類型（百普素）等所含蛋白質(zhì)為蛋白水解物，在小腸中也有運(yùn)輸?shù)途垭牡捏w系，低聚肽經(jīng)小腸粘膜刷狀緣的肽酶水解后進(jìn)入血液，容易被機(jī)體利用。同時(shí)不含乳糖，避免了乳糖不耐受引起的腹瀉和脂代謝障礙等一系列問題。幾乎完全吸收，低渣，需少量消化液吸收，排糞便量少。適用于有胃腸道功能或部分胃腸道功能的患者。如：胰腺炎；腸道炎性疾??；放射性腸炎和化療；腸瘺；短腸綜合征；艾滋病病毒感染等。也可作為營養(yǎng)不足病人的手術(shù)前后喂養(yǎng)及腸道準(zhǔn)備。能補(bǔ)充人體日常生理功能所需的能量及營養(yǎng)成分。

3．整蛋白型（劑型有：乳劑、混懸液、粉劑），此類制劑最多也容易混淆，但是只要按照標(biāo)準(zhǔn)分類，仍然是容易理解的。

（1）平衡型普通整蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)：常見的商品名有腸內(nèi)營養(yǎng)制劑TP（安素）、腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑TP（瑞素）等。該型制劑進(jìn)入胃腸道后可刺激消化腺體分泌消化液，幫助消化、吸收，在體內(nèi)消化吸收過程同正常食物，可提供人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)和能量的需要。其中有些制劑含有中鏈三酰甘油（如瑞素），更有利于脂肪的代謝吸收；有些制劑為了節(jié)約入液量而制成高能量密度，每1ml提供1.3-1.5Kcal的能量（如腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（TP-HE）（瑞高），腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液（TPF）（能全力1.5））。還有些制劑添加了膳食纖維以改善胃腸道功能（如腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（TPF-D）（瑞代），能全力、瑞先等）。不同的制劑因產(chǎn)品特色不一而同時(shí)屬于不同類型，但只要了解其特殊之處就不會分錯了。這一大類制劑適于面或頸部創(chuàng)傷，或顱頸部手術(shù)后；咀嚼和吞咽功能性或神經(jīng)性損害，或咽下困難；意識喪失的病人和/或接受機(jī)械通氣的病人；以及高分解代謝狀態(tài)，如癌癥、燒傷和顱腦創(chuàng)傷病人；神經(jīng)性畏食等。

（2）疾病適用型整蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)：有糖尿病型腸內(nèi)營養(yǎng)制劑（如腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（TPF-D）瑞代）、腫瘤適用型腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（如腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（TPF-T）（瑞能））、高蛋白、高能量腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（如瑞高、瑞先）、免疫增強(qiáng)型腸內(nèi)營養(yǎng)（如茚沛）、肺病型腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液（如易菲佳）、腎病用復(fù)方a-酮酸類似物（如開同）等。

二、EN的禁忌癥及注意事項(xiàng)

EN不是萬能的，在臨床治療中有些情況是不適合用的。EN不能應(yīng)用于完全腸梗阻，嚴(yán)重的短腸綜合征或高排泄量的瘺。在半乳糖血癥患者，嚴(yán)重腹腔內(nèi)感染者也禁用。并且嚴(yán)格禁忌靜脈內(nèi)輸入EN。

使用EN應(yīng)注意定期監(jiān)測生化指標(biāo)，使用前搖勻，在有效期內(nèi)使用。藥品應(yīng)在25℃以下密閉保存。開啟后冰箱內(nèi)(2 – 10℃)保存并于24h內(nèi)用完。

三、早期應(yīng)用EN是醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢

當(dāng)患者食欲、飲食下降時(shí)，應(yīng)早期考慮給予腸內(nèi)營養(yǎng)支持，可預(yù)防營養(yǎng)不足，并對疾病康復(fù)有一定幫助。

1、給藥途徑可根據(jù)患者的情況選擇：分次口服、鼻飼、胃造瘺、空腸造口等。

2、給藥方法均可通過患者胃腸道的耐受情況由少量逐漸增至患者的需要量。

3、喂養(yǎng)管的材料選擇，目前首選聚氨酯的導(dǎo)管較多，此管柔軟，患者耐受性好，導(dǎo)管對pH不敏感。聚氯乙烯的導(dǎo)管含增塑劑，較硬、對pH敏感，易出現(xiàn)咽炎，病人耐受性不好，使用時(shí)間短。硅膠材質(zhì)的導(dǎo)管柔軟，操作時(shí)不易置入，另外管壁內(nèi)粗糙，故易發(fā)生堵塞。

總之，對使用EN治療的患者及家屬，應(yīng)該定時(shí)宣教，使他們了解EN的重要性，掌握一般的護(hù)理知識，有效地預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生。