急求：離子交換柱層析分離氨基酸的講義

一、目的

學習用陽離子交換樹脂柱分離氦基酸的操作方法和基本原理.

二、原理

各種氨基酸分子的結(jié)構(gòu)不同,在同一PH時與離子交換樹脂的親和力有差異,因此可依親和力從小到大的順序被洗脫液洗脫下來,達到分離的效果.

三、器材

1、20cmX 1cm層析管 2、試管

3、吸管． 4、恒壓洗脫瓶

5、部分收集器 6、搪磁杯

7、電爐 8、分光光度計

四、試劑和材料

1、．苯乙烯磺酸鈉型樹脂（強酸 lx 8,l00一200目,可用上海華東化工學院產(chǎn)品）

2 、2 mol／L鹽酸溶液

3、2mol／L氫氧化鈉溶液

4、標準氨基酸溶液 天冬氨酸、賴氨酸和組氨酸均配制成 2 mg／mL的0.1M鹽酸溶液.

5、混合氫基酸溶液將上述天冬氨酸、賴氨酸和組氨酸溶液按1：2．5：10的比例混合.

6、檸檬酸－氫氧化鈉一鹽酸沖液（pH5.8）,鈉離子濃度0 .45M）

取檸檬酸（C6O7H8.H20 ）14.25g、氫氧化鈉9.30g和 濃鹽酸 5．25 mL溶于少量水后,定容至 500 mL,冰箱保存.

7、顯色劑 2 g水合茚三酮溶于 75mL乙二醇單甲醚中．加水至 100 mL.

8、50%乙醇水溶液

五、操作

1、層析柱的準備：將強酸型陽離子交換樹脂用氫氧化鈉處理成Na+型后洗至中性（處理方法見第三篇實驗十二）．攪拌一小時后裝成一個直徑1cm．高 16～18 cm的層析柱.

2、氨基酸的洗脫：用P H5.8的檸檬酸緩沖液流洗平衡交換?。ㄑb置如圖）.調(diào)節(jié)流速為 0.5 mL／min,流出液達床體積的4倍時即可上樣.由柱上端仔細加人氨基酸混合液0．25—0．5 mL,同時開始收集流出液.當樣品液彎月面靠近樹脂頂端時,即刻加入0.5 mL擰檬酸緩沖液沖洗加樣品處.待緩沖液彎月面靠近樹脂頂端時.再加入0．5 mL緩沖液.如此重復兩次,然后用滴管小心注入檸檬酸緩沖液（切勿攪動床面）,并將柱與洗脫瓶和部分收集器相連.開始用試管收集洗脫液,每管收集lmL．共收集60一80管.

3、氨基酸的鑒定：向各管收集液中加lmL水合茚三酮顯色劑并混勻,在沸水浴中淮確加熱15分鐘后冷卻至室溫．再加15 mL的50％乙醇液.放置10分鐘.以收集液第2管為空白,測定A570nm波長的光吸收值.以光吸收值為縱坐標,以柱洗脫體積為橫坐標繪制洗脫曲線.以已知3種氨基酸的純?nèi)芤簽闃悠?按上述方法和條件分別操作,將得到的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對照．可確定3個峰的大致位置及各蜂為何種氨基酸.

測定植物中游離氨基酸總量實驗中的“標準氨基酸”應該用什么氨基酸？

α-氨基酸與茚三酮反應生成藍紫化合物，在570nm有強吸收。谷氨酸也可以配標準氨基酸溶液，還是570nm下測OD值。

2.5%的酸性茚三酮顯色液怎么配置

配置方法：

1，用雙蒸水配制0.5mg?ml－1的標準氨基酸溶液50ml。

2，然后用0.5mg?ml－1的氨基酸溶液在25ml刻度試管中配置0mg?ml－1、0.1 mg?ml－1、0.2 mg?ml－1、0.3 mg?ml－1、0.4 mg?ml－1、0.5mg?ml－1溶液各1ml，加水補足至4ml。

3，然后加入2%茚三酮(取茚三酮0.1g，溶于25mL熱水，加入氯化亞錫40mg后過濾，濾液置冷暗出過夜，定容至50mL)和緩沖液各1ml，搖勻，置沸水浴中加熱15min，迅速冷卻，定容。

4，靜置15min，以試劑空白調(diào)零，測定各濃度AA溶液的吸光度值A570nm。