用高效液相色譜法測定氨基酸時為什么要進(jìn)行氨基酸的衍生

建立一種準(zhǔn)確、快速柱前衍生高效液相色譜法測定腦卒中患者血清 中18種游離氨基酸的方法,為臨床治療腦卒中提供依據(jù).方法：利用高效液相色譜二極管陣列檢測法對AQC衍生的氨基酸產(chǎn)物進(jìn)行分離.采用thermo C18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱,PH 5.09的乙酸銨溶液和60％的乙腈水溶液為流動相,檢測波長248nm,利用梯度洗脫的方式測定血清中1 8種氨基酸.結(jié)果：谷氨酰胺在0.0125-2mmol/L濃度范圍內(nèi),胱氨酸在0.00625-0.25mmol/L濃度范圍內(nèi),其余16種氨基酸在 0.0 125-0.5mmol/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.R2為0.9907-0.9999,RSD為1-4％.結(jié)論：利用此方法可以檢測缺血性腦卒中患者血 清中游離氨基酸,測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠,方法簡單易行.

氨基酸的分析的三組檢驗方法？

1. 分光光度法氨基酸檢測：主要是利用氨基酸與衍生劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，該化合物在某一波長處有最大吸收峰，根據(jù)吸收值大小得到氨基酸含量。常用的衍生劑為茚三酮。

2. 毛細(xì)管電泳法氨基酸檢測：根據(jù)分離原理的不同，可分為毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等電電泳、毛細(xì)管等速電泳以及膠束電動力學(xué)毛細(xì)管電泳。其中，毛細(xì)管區(qū)帶電泳和膠束電動力學(xué)毛細(xì)管電泳可用于氨基酸檢測。

3. 近紅外光譜法氨基酸檢測：利用有機(jī)化合物的含氫基團(tuán)在特定波長區(qū)域躍遷，產(chǎn)生光譜的變化，結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法間接地實現(xiàn)氨基酸的定量檢測。

4. 氣相色譜法氨基酸檢測：將氨基酸衍生化處理變?yōu)槿菀讱饣奈镔|(zhì)，根據(jù)氣態(tài)樣品中各組分在流動相和固定相中的分配系數(shù)的不同，實現(xiàn)對氨基酸的定量分析。

5. 高效液相色譜法氨基酸檢測：是最常用的一種氨基酸檢測方法。由于大多數(shù)氨基酸本身沒有紫外吸收和熒光反應(yīng)，因此需要對樣品進(jìn)行衍生化處理將其轉(zhuǎn)化為有紫外吸收和發(fā)射熒光的物質(zhì)，衍生可分為柱前衍生和柱后衍生。

氨基酸的檢測方法有哪些

1. 分光光度法氨基酸檢測：主要是利用氨基酸與衍生劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，該化合物在某一波長處有最大吸收峰，根據(jù)吸收值大小得到氨基酸含量。常用的衍生劑為茚三酮。

2. 毛細(xì)管電泳法氨基酸檢測：根據(jù)分離原理的不同，可分為毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等電電泳、毛細(xì)管等速電泳以及膠束電動力學(xué)毛細(xì)管電泳。其中，毛細(xì)管區(qū)帶電泳和膠束電動力學(xué)毛細(xì)管電泳可用于氨基酸檢測。

3. 近紅外光譜法氨基酸檢測：利用有機(jī)化合物的含氫基團(tuán)在特定波長區(qū)域躍遷，產(chǎn)生光譜的變化，結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法間接地實現(xiàn)氨基酸的定量檢測。

4. 氣相色譜法氨基酸檢測：將氨基酸衍生化處理變?yōu)槿菀讱饣奈镔|(zhì)，根據(jù)氣態(tài)樣品中各組分在流動相和固定相中的分配系數(shù)的不同，實現(xiàn)對氨基酸的定量分析。

5. 高效液相色譜法氨基酸檢測：是最常用的一種氨基酸檢測方法。由于大多數(shù)氨基酸本身沒有紫外吸收和熒光反應(yīng)，因此需要對樣品進(jìn)行衍生化處理將其轉(zhuǎn)化為有紫外吸收和發(fā)射熒光的物質(zhì)，衍生可分為柱前衍生和柱后衍生。

高效液相色譜儀和氨基酸分析儀的區(qū)別與聯(lián)系

由于氨基酸沒有紫外吸收，必須進(jìn)行衍生化才能進(jìn)行紫外檢測器測定，氨基酸分析儀與高效液相相比，比高效液相多了一個柱后衍生化系統(tǒng)。其它沒有本質(zhì)的區(qū)別，但氨基酸分析儀的整機(jī)設(shè)計更加專業(yè)化，更有針對性，相反，一般的高效液相則具有較好的通用性。

如何用液相色譜儀測氨基酸

反相高效液相色譜法測定煙葉中的游離氨基酸

氨基酸是煙草中的一類重要化學(xué)物質(zhì)，在煙草調(diào)制、醇化或發(fā)酵、加工直至燃燒過程中，游離氨基酸與還原糖之間可發(fā)生酶催化及非酶催化的棕色化反應(yīng)，生成多種具有蒸煮、烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶類等雜環(huán)化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸還可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量與煙草制品的吃味有著密切的關(guān)系，氨基酸在燃燒裂解過程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，對煙氣香吃味產(chǎn)生不良影響，個別氨基酸還產(chǎn)生HCN等危害健康的煙氣成分。一般說來，氨基酸含量太高，煙氣辛辣、味苦、刺激性強(qiáng)烈；含量太低時煙氣則平淡無味缺少豐滿度。因此對氨基酸的分析是一項很有意義的工作，二十世紀(jì)60年代以來，國內(nèi)外在這方面做了大量的工作[1-5]。

植物游離氨基酸樣品的制備，國內(nèi)外采用的提取劑和純化方法各不相同。據(jù)文獻(xiàn)報道[6-7]，鹽酸、不同濃度的乙醇溶液均可以用來提取植物組織中的游離氨基酸；提取液純化則有用陽離子交換樹脂、5%磺基水楊酸、活性炭或乙醚等方法。本實驗對不同的提取方式和不同的純化方法進(jìn)行了對比研究，確定提取煙葉中游離氨基酸的較佳提取劑和純化方法。提取、純化后的樣品，采用OPA、FMOC聯(lián)合柱前衍生反相高效液相色譜法對煙葉中的游離氨基酸進(jìn)行了測定。該方法使帶氨基和亞氨基基團(tuán)的氨基酸能夠被同時測定，且得到較好的定性定量結(jié)果。

1 實驗

1.1 儀器

Agilent公司HP1100型高效液相色譜儀(帶可變波長紫外檢測器和自動進(jìn)樣器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可見分光光度計。

1.2 試劑

正纈氨酸（Norvaline，內(nèi)標(biāo)），OPA ，F(xiàn)MOC，均為色譜純，Agilent公司提供；硼酸緩沖溶液，Agilent公司提供；

醋酸鈉(NaAc)，分析純，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；三乙胺（TEA），四氫呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均為色譜純，F(xiàn)isher公司試劑；

氨基酸標(biāo)樣包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均為生化試劑，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；

苯乙烯陽離子交換樹脂（732型），天津樹脂廠。

1.3 樣品處理

將煙葉在烘箱中恒溫40℃烘干至恒重，粉碎，過80目篩，篩下物為實驗用煙樣粉末，置于廣口瓶中備用。準(zhǔn)確稱取煙樣粉末1.000g于干燥的潔凈試管中，用一定濃度的乙醇溶液室溫超聲波提取半小時，過濾，相同濃度的乙醇溶液洗滌，再提取一次，合并后的濾液用陽離子交換柱洗脫，然后用95ml 4mol/L氨水淋洗陽離子交換柱，淋洗液恒溫濃縮至干，最后用3ml 0.1mol/L稀鹽酸溶液溶解濃縮物，將此溶液離心分離20min，0.45μm微孔濾膜過濾，加入濃度為5nmol/μ1的內(nèi)標(biāo)10μ1，定容至50ml，HP1100液相色譜儀進(jìn)行氨基酸分析。

樣品自動柱前衍生化：Agilent公司G1313A自動進(jìn)樣器進(jìn)樣。程序為：吸取5μl硼酸緩沖液，再吸取1μ1 OPA試劑，洗針一次，吸取樣品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC試劑，洗針一次，原位混合3次，進(jìn)樣。

1.4 色譜條件

色譜柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm

流動相A：1.36±0.025g醋酸鈉，加入500ml純水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸調(diào)pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氫呋喃，混合均勻。

流動相B：1.36±0.025g醋酸鈉，加入100ml純水溶解，用1%醋酸調(diào)pH=7.20±0.05，將此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，并混合均勻。

流速：0.45ml/min

柱溫：40℃

紫外檢測波長: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm

淋洗梯度：見表1

表1 流動相的淋洗梯度表

Table 1 The gradient time table of mobile phase

序列 時間（min） 流動相A（%） 流動相B（%） 流速（ml/min）

1 0.00 100.0 0.0 0.450

2 15.50 40.0 60.0 0.450

3 18.00 0.0 100.0 0.450

4 21.00 0.0 100.0 0.800

5 23.90 0.0 100.0 0.800

6 24.00 0.0 100.0 0.450

7 25.00 100.0 0.0 0.450

1.5 氮基酸的定性

用標(biāo)樣色譜圖、文獻(xiàn)參照和標(biāo)樣加入的方法，通過對照保留時間進(jìn)行定性，對氨基酸的出峰順序加以確認(rèn)。

1.6 內(nèi)標(biāo)法定量

準(zhǔn)確移取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標(biāo)樣100μl于帶內(nèi)襯管的樣品瓶中，再加入250pmol/μ1內(nèi)標(biāo)溶液100μl，充分混合，液相色譜分析，儀器自動計算各氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑的比較

氨基酸可溶解于水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它們均可作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑，傳統(tǒng)的方法是用乙醇和0.1mol/L的鹽酸。實驗發(fā)現(xiàn)，乙醇和0.1mol/L的鹽酸萃取方法比較，提取出的煙葉中的游離氨基酸的總量變化不大，但用鹽酸提取的樣品分析時RSD%較大，平均8.51%，其中超過10%的有4個，甘氨酸的RSD%最大為20%；而用乙醇提取的樣品分析時RSD%相對較小，平均5.12%，超過10%的只有1個。而且鹽酸提取液過濾速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液過濾只需10min左右；因此，本實驗選擇乙醇作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑。

2.2 乙醇濃度的選擇

選擇五種不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行了煙樣中游離氨基酸的提取，測定不同條件下提取液中游離氨基酸的總量，結(jié)果如圖1。圖中顯示，在乙醇溶液濃度為80%時，煙樣中總游離氨基酸的提取量最大。而且不同濃度下游離氨基酸的RSD%沒有明顯的變化，因此，選擇80%的乙醇溶液來進(jìn)行煙樣中游離氨基酸的提取。

2.3 不同純化方法的確定

在最佳乙醇溶液濃度下，分別用活性炭加入提取液吸附雜質(zhì)、乙醚加入提取液萃取分離雜質(zhì)、5%磺基水楊酸加入提取液沉淀去除雜質(zhì)和陽離子交換樹脂吸附雜質(zhì)四種方法進(jìn)行了純化實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性炭作為純化劑時其色譜圖中雜質(zhì)峰較少，但同時氨基酸峰亦有多個消失，主要是因為活性炭對氨基酸也有較強(qiáng)的吸附，它在吸附雜質(zhì)的同時也吸附了需要檢測的氨基酸，故活性炭不適合作為純化劑使用。乙醚和5%磺基水楊酸作為純化劑時，雜質(zhì)去除不完全，其色譜圖均表現(xiàn)為雜質(zhì)峰較多，湮沒了大量氨基酸峰，且基線漂移嚴(yán)重，給定性定量工作帶來困難。當(dāng)用陽離子交換樹脂進(jìn)行純化時，其色譜圖中雜質(zhì)峰較少，基線平穩(wěn)，氨基酸峰分離較好，均可以進(jìn)行定性和定量分析，故本實驗選擇了陽離子交換樹脂作為純化手段。

2.4 色譜分離

2.5 線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標(biāo)樣加入等體積的250 pmol/μ1的內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)行HPLC分析，以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，氨基酸與內(nèi)標(biāo)的面積比為縱坐標(biāo)，得到各個氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2所示。從表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的濃度范圍內(nèi)均有良好的線性，各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

表2 氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Table 2 Standard curves of 17 amino acids

氨基酸 線性方程 相關(guān)系數(shù)

Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972

Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961

Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988

His Y=0.003719x+0.020168 0.9945

Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966

Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978

Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912

Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920

Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993

Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985

Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927

Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905

Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962

Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953

Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964

Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969

Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922

2.6 重現(xiàn)性實驗

取云南C2F99煙樣做平行實驗（n=5），進(jìn)行煙葉中游離氨基酸含量的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： Asp和 Glu含量的RSD%分別為8.0%和8.6%，這可能是二者的分離度不高引起的；His的RSD%為9.0%，這可能與其含量較低，分離效果不好有關(guān)。其它氨基酸含量的RSD%均處在3%～7%。

2.7 回收率實驗

用標(biāo)樣加入法進(jìn)行回收率實驗，結(jié)果見表3。 Thr的回收率僅為68.0%，原因可能與其含量較少有關(guān)；其它15種氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率為93.9%，說明該方法的回收率結(jié)果令人滿意。

表3 分析方法的回收率

Table 3 Recovery percents of the analytical method

氨基酸 加入量（mg/g煙樣） 樣品含量（mg/g煙樣） 測定值（mg/g煙樣） 差值（mg/g煙樣） 回收率%

Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5

Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5

Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0

Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0

Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0

His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5

Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5

Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0

Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5

Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5

Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5

Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0

Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5

Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5

Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5

Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5

2.8 樣品分析

利用該方法對不同等級的煙葉中游離氨基酸的含量進(jìn)行了分析，結(jié)果見表4。從表中可以看出，在所分析的樣品中，烤煙煙葉中含量最高的氨基酸是Pro，白肋煙煙葉中含量最高的氨基酸是Asp和Asn；白肋煙煙葉中氨基酸的含量高于烤煙煙葉；相同等級的烤煙煙葉，云南煙葉中的氨基酸含量高于其它產(chǎn)區(qū)。

表4 不同等級煙葉中游離氨基酸的含量（mg/g煙樣）

Table 4 Amounts of free amino acids in different

grade tobacco leaves（mg/g tobacco leaves）

氨基酸 云南烤煙C1F 云南烤煙C2F 云南烤煙C1L 云南烤煙B1F 云南烤煙B2F 福建烤煙B1F 福建烤煙C1F 四川烤煙C1F 四川烤煙B1F 貴州烤煙C1F 貴州烤煙B1F 貴州烤煙C1L 鄂西白肋中一 鄂西白肋中二

Asp 0.24 0.31 0.60 0.40 0.38 0.37 0.26 0.37 0.26 0.26 0.32 0.35 1.73 1.59

Glu 0.36 0.32 0.21 0.17 0.16 0.11 0.15 0.20 0.30 0.32 0.29 0.25 0.54 0.61

Asn 0.91 0.34 1.50 0.95 0.38 0.18 0.25 0.35 0.32 0.44 0.55 0.48 7.70 7.62

Ser 0.16 0.10 0.18 0.16 0.10 0.12 0.24 0.21 0.19 0.20 0.19 0.15 0.62 0.58

Gln 0.19 0.05 0.22 0.17 0.04 0.06 0.10 0.11 0.10 0.11 0.15 0.10 0.18 0.20

His 0.11 0.02 0.14 0.10 0.06 0.06 0.11 0.09 0.07 0.09 0.08 0.09 0.20 0.22

Gly 0.10 0.09 0.19 0.17 0.07 0.08 0.12 0.15 0.12 0.15 0.13 0.12 0.16 0.19

Thr 0.05 0.05 0.08 0.06 0.05 0.04 0.08 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.19 0.16

Ala 0.65 0.55 0.84 0.69 0.54 0.51 0.65 0.59 0.55 0.48 0.53 0.70 0.57 0.55

Arg 0.29 0.21 0.32 0.28 0.18 0.26 0.32 0.28 0.25 0.33 0.29 0.33 0.48 0.42

Tyr 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.10 0.15

Val 0.10 0.10 0.12 0.11 0.10 0.14 0.15 0.13 0.12 0.15 0.14 0.13 0.21 0.25

Met 0.07 0.07 0.09 0.08 0.06 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.12 0.13

Phe 0.26 0.12 0.28 0.23 0.10 0.21 0.25 0.21 0.25 0.28 0.30 0.33 0.44 0.59

Pro 1.14 0.83 2.13 1.51 0.69 0.66 1.03 1.23 1.11 1.32 1.18 1.09 0.25 0.35

總量 4.69 3.23 6.96 5.15 2.97 2.91 3.86 4.14 3.86 4.33 4.37 4.31 13.49 13.61

3 結(jié)論

本煙葉中游離氨基酸的分析方法采用80%的乙醇作為萃取溶劑，陽離子交換樹脂對提取液進(jìn)行純化，能夠最大程度地提取煙葉中的游離氨基酸并較好地去除了影響氨基酸測定的雜質(zhì)，使色譜圖中雜質(zhì)峰較少；OPA、FMOC聯(lián)和柱前衍生使帶氨基和亞氨基基團(tuán)的氨基酸同時得到測定；良好的梯度洗脫使各個氨基酸峰得到較好的分離，并使定量結(jié)果更加可靠。