測定蛋白質(zhì)中氨基酸含量的主要步驟有哪些？為什么一般分析報(bào)告顯示17種氨基酸成分？

一般來說人體必須的17種氨基酸，也較為重視

氨基酸的定性測定

一、氨基酸的一般顯色反應(yīng)

本節(jié)介紹三種顯色反應(yīng)：茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二甲醛法。前二種是經(jīng)典的常用顯

色法，后一種是近年來發(fā)展起來的熒光顯色法，具有靈敏度高的特點(diǎn)。

1. 茚三酮法

顯色方法有下列數(shù)種：

①常用法：將點(diǎn)有樣品的層析或電泳完畢的濾紙充分除盡溶劑，用 5g/L 茚三酮無水丙

酮溶液噴霧，充分吹干，置65℃烘箱中約30min（溫度不宜過高，避免空氣中氨，以免背

景泛紅色），氨基酸斑點(diǎn)呈紫紅色。

為了使各種氨基酸呈現(xiàn)不同顏色，可用下列方法：

②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液顯色。

③用 1g/L 茚三酮無水丙酮溶液顯色完畢后，再用鹽酸蒸汽熏1min。

④用 1g 茚三酮，600mL 無水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80

℃染色5～10min。

為了使顯色穩(wěn)定，可用下列方法：

⑤配制含醋酸鎘 2g 加蒸餾水200mL 及冰醋酸40mL 的貯存液。將上述貯存液加200mL

丙酮及2g 茚三酮，即為顯色液。點(diǎn)有樣品的濾紙上浸有此顯色液后，放置于盛有一小杯濃

硫酸的密閉玻璃容器中，25℃，18h，或較高溫度下適當(dāng)縮短時(shí)間。背景色淺，氨基酸斑點(diǎn)

也比較穩(wěn)定。

⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮異丙酮溶液顯色時(shí)，氨基酸斑點(diǎn)呈紅色，也

可在茚三酮顯色后噴以含鈷、鎘或銅等無機(jī)離子的異丙醇溶液，斑點(diǎn)自藍(lán)紫色變成紅色。

2．吲哚醌法

（1）原理

各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可借此辯認(rèn)氨基酸。氨對吲哚醌顯色沒

有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩(wěn)定，顏色只有在絕對干燥的環(huán)境中才能保存。

（2）試劑

①顯色劑：1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量減少則靈敏度

稍差）。

②底色褪色劑：在 100mL 200g/L 碳酸鈉溶液中加入60g 硅酸鈉（Na2SiO3?9H2O）在水

?。?0～70℃）中加熱攪拌直至完全溶解，待溶液比較清澈為止。在溶解過程中，有時(shí)硅酸

鈉會結(jié)成凝膠，此時(shí)只需繼續(xù)攪拌即可溶解。配制時(shí)若硅酸鈉用量多則褪色較快，但背景容

易變黃，硅酸鈉用得少（40g），雖裉色較慢，但背景較為潔白。

顯色步驟

層析或電泳后濾紙烘干后，仔細(xì)噴上或涂上顯色劑，用電吹風(fēng)迅速吹干，待醋酸氣味不

太刺鼻時(shí)移置100℃烘箱烘5～15min，直至顯色為止（溫度不要太高，以免引起減色）注

意觀察所顯出的顏色，然后均勻地涂上底色褪色劑，紙的背景即由黃色變?yōu)榻{紅而后逐漸變

淺，待黃色背景幾乎褪盡時(shí)，迅速用電吹風(fēng)吹干，并隨時(shí)觀察顏色的變化。例如蘇氨酸在褪

色前為淺紅帶褐色，褪色后則呈橙黃色或黃色：脯氨酸在褪色前為藍(lán)色，吹干時(shí)很快褪成無

色。室溫較低時(shí)，底色褪色很慢，此時(shí)可將褪色劑加溫到30～40℃。溫度過高也不宜，因

氨基酸斑點(diǎn)的褪色速度也同時(shí)加快，應(yīng)該避免。

其他顯色步驟：顯色劑為 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸鋅溶解于70～80mL 熱異丙醇中，冷卻

后加1mL 吡啶?；蛘?g 吲哚醌，1.5g 醋酸鋅溶解于95mL 熱異丙醇中，加3mL 水，冷卻

后加1mL 冰醋酸。點(diǎn)有樣品的濾紙仔細(xì)噴以顯色劑后，80～85℃放置10min，背景可用水

迅速浸洗去而不使氨基酸斑點(diǎn)退去

由于吲哚醌試劑配制方法不同，對同一種氨基酸所顯顏色往往也有差異。

3．鄰苯二甲醛法

鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可

用于氨基酸溶液定量，并推廣應(yīng)用于乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的檢出和定量。根

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氨基酸紙上層析靈敏度達(dá)0.5μmoL，在硅膠薄層層析上為0.05～0.2μmoL。

這里介紹在紙上層析顯現(xiàn)氨基酸方法。（熒光胺是另一種常用的熒光試劑，由于熒光胺來源

比較困難，這里未作介紹）

（1）原理

鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適

的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為340nm 和455nm。

各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同，其相對熒光強(qiáng)度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，

異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨

酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。

（2）試劑

鄰苯二甲醛顯色液：取0.1g 鄰苯二甲醛，0.1mg 巰基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油

醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶劑至100mL。放置0.5h 后使用。

顯色步驟

將含有氨基酸樣品的濾紙浸入鄰苯二甲醛顯色液中 1min，冷風(fēng)吹干，在溫度18℃以下，

濕度50%～90%之間顯色0.5h，于紫外燈下觀察熒光點(diǎn)。

說明

在濾紙上顯現(xiàn)氨基酸時(shí)，鄰苯二甲醛濃度以 0.1%為宜。顯色時(shí)必須有一定的濕度，以

便氨基酸溶解，提高分子碰撞機(jī)率，并使極性基團(tuán)解離，促進(jìn)反應(yīng)趨于完全。濕度太低，顯

不出熒光。溫度對顯現(xiàn)的熒光延時(shí)有顯著影響，溫度高熒光延時(shí)短，溫度低熒光延時(shí)長。

二、個(gè)別氨基酸的顯色反應(yīng)

利用個(gè)別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應(yīng)定性氨基酸?？蓱?yīng)用于紙層析和紙電

泳顯色，也可單獨(dú)應(yīng)用。方法很多，僅將常用的方法介紹如下：

1．精氨酸的顯色——坂口（Sakaguchi）反應(yīng)

(1)第一種方法

試劑：①5g 尿素溶解于100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加約5g KOH。

②0.7mL 溴水溶解于100mL 5%NaOH 中。

顯色步驟：在點(diǎn)有樣品的濾紙上噴試劑①后，在空氣中吹幾分種，再噴試劑②。精氨

酸或含精氨酸的多肽顯紅色。此試劑對含精氨酸的蛋白質(zhì)也適用。

(2)第二種方法：

試劑：①1g/L 8-羥基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解于100mL 0.5mol/LnaOH 溶

液中。

顯色步驟：將點(diǎn)有樣品的濾紙烘干后，噴上試劑①，吹干后，再噴試劑②。精氨酸或

其他胍類物質(zhì)顯桔紅色。

2．胱氨酸和半胱氨酸的顯色

試劑：①1.5g 亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5NO2?5H2O）溶于5mL 2mol/L H2SO 4 溶液

中，加95mL 甲醇。此時(shí)會有沉淀產(chǎn)生，可保存一個(gè)月以上。使用時(shí)在每100mL 上述溶液

中加10mL 28%氨水，過濾除去沉淀，清液僅能保持一天左右。②2g 氰化鈉溶于5mL 水中，

然后加95mL 甲醇。此時(shí)有沉淀產(chǎn)生，使用時(shí)只需搖勻即可。

顯色步驟：半胱氨酸的顯色：在濾紙上噴以試劑①的清液，5min 后半胱氨酸顯紅色。

胱氨酸的顯色：先將濾紙浸入試劑②，迅速取出，稍等片刻再噴試劑甲的清液，5min 后胱

氨酸顯紅色。也可以把試劑②配制的濃度增加一倍，在顯色前混和，再噴到濾紙上。

3．甘氨酸的顯色

試劑；0.1g 鄰苯二甲醛溶于100mL 77%乙醇中。

顯色步驟：點(diǎn)有樣品的濾紙噴上試劑，甘氨酸顯墨綠色，在汞燈（365nm）下顯巧克力

棕色。吲哚醌顯色后，再用此試劑仍有效。以甘氨酸為N 端的小肽也能顯色，但其N 端被

保護(hù)后，以及其他氨基酸均不顯色。

4．脯氨酸的顯色

試劑：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸鋅，1mL 醋酸，5mL 蒸餾水混和，再加入95mL 異丙醇。

新鮮配制。

顯色步驟：層析濾紙除盡溶劑，噴上以上試劑，80℃～85℃烘箱內(nèi)放置30min，脯氨酸

顯藍(lán)色，再以30℃溫水漂洗除去多余的試劑后，背景為白色或淺黃色。

也可剪下脯氨酸斑點(diǎn)，在試管中加入5mL 水飽和酚，在黑暗中洗脫15min，間歇振搖，

于610nm 測定其吸光度。從已知標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得樣品內(nèi)脯氨酸含量，測定范圍5～20μg。

5．絲氨酸和羥賴氨酸的顯色

試劑：①0.035mol/L 過碘酸鈉（748mgNaIO4 溶于數(shù)毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 鹽酸，

再用甲醇稀釋至100mL）。②15g 醋酸銨加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙酰丙酮，用甲醇稀釋到

100mL。

顯色步驟：點(diǎn)有樣品的濾紙吹干，先噴試劑①，近干后再噴試劑②，室溫放置 2h，紫

外燈下照射0.5h，絲氨酸和羥賴氨酸呈黃色斑點(diǎn)，在紫外線下都有熒光。

6．羥脯氨酸的顯色

試劑：①1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 對二甲胺苯甲醛溶于100mL

的丙酮濃鹽酸（9＋1）混合液中。（此試劑不穩(wěn)定，隔數(shù)日后溶液顏色增深發(fā)黑，靈敏度降

低，故用時(shí)新鮮少量配制。

顯色步驟：將待鑒定的溶液點(diǎn)于小方塊紙上，干后先點(diǎn)上試劑①，熱風(fēng)吹干。這時(shí)純

羥脯氨酸呈墨綠色，純脯氨酸呈深藍(lán)色（極靈敏），對其他氨基酸呈程度不同的紫紅色（不

太靈敏）；然后再點(diǎn)上試劑②吹干，如溶液中含有羥脯氨酸即轉(zhuǎn)變?yōu)槊倒寮t色，而其他氨基

酸與吲哚醌所生成的顏色則褪去。

7．色氨酸的顯色

(1)第一種方法

試劑：1g 對二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 濃鹽酸。新鮮配制。

顯色步驟：點(diǎn)有樣品的濾紙干燥后，噴上以上試劑，在室溫下放置幾分鐘后，色氨酸

顯藍(lán)色或紫紅色。茚三酮顯色后，仍可使用本法。

(2)第二種方法：

試劑：10mL 35%甲醛加10mL25%鹽酸，20mL 無水乙醇。

顯色步驟：點(diǎn)有樣品的濾紙噴上以上試劑后，100℃烘5min，色氨酸在長波長紫外光下

呈現(xiàn)熒光（黃-橙-帶綠色）。

8．酪氨酸的顯色

試劑：①0.1%α-亞硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。

顯色步驟：點(diǎn)有樣品的濾紙噴上試劑①后，吹干，再噴試劑②，然后在100℃烘3min，

酪氨酸或含酪氨酸的多肽在淺灰綠色的背景上顯紅色，0.5h 后轉(zhuǎn)變?yōu)榻奂t色，其后漸退去。

靈敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮顯色后，再用此試劑處理，仍能顯色，茚三酮所顯出的紫紅

色斑點(diǎn)變成紅色。

9．酪氨酸和組氨酸的顯色——pauly 反應(yīng)

試劑：①4.5g 對氨基苯磺酸與45mL 12mol/L 鹽酸共熱溶解，以蒸餾水稀釋至500mL。

用時(shí)取出30mL，在0℃與等體積的5%亞硝酸鈉水溶液相混合。（室溫放置太長會失效）

②10%碳酸鈉水溶液。

顯色步驟：點(diǎn)有樣品的濾紙上噴試劑①，片刻后再噴試劑②。組氨酸及含組氨酸的多

肽顯桔紅色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽顯淺紅色。

第六節(jié) 氨基酸定量測定

一、氨基酸的一般定量測定

（一）甲醛滴定法

1．原理

氨基酸具有酸性的-COOH 基和堿性的-NH2 基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)

鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2 基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)堿

溶液來滴定-COOH 基，并用間接的方法測定氨基酸總量。反應(yīng)式（有三種不同的推論）如

下：

2．方法特點(diǎn)及應(yīng)用

此法簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮?dú)馊萘糠ǚ治鼋Y(jié)果相近。在發(fā)酵工業(yè)中常用此

法測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，來了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此

作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低；酪

氨酸含有酚羧基，滴定時(shí)也會消耗一些堿而致使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反

應(yīng)，往往使結(jié)果偏高。

3．操作方法

吸取含氨基酸約 20mg 的樣品溶液于100mL 容量瓶中，加水至標(biāo)線，混勻后吸取20.0mL

置于200mL 燒杯中，加水60mL，開動磁力攪拌器，用0.05mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至

酸度計(jì)指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液mL 數(shù)，供計(jì)算總酸含量。

加入10.0mL 甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄消

耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)。

同時(shí)取 80mL 蒸餾水置于另一200mL 潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至pH8．2，

（此時(shí)不計(jì)堿消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定

至pH9.2，作為試劑空白試驗(yàn)。

4．結(jié)果計(jì)算

氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）=

式中：V1——樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點(diǎn)（pH9.2）所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液

的體積，mL；

V2——空白試驗(yàn)加入甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

m——測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g；

0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmoL。

5．說明

①本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定。②渾濁和色深樣液可不經(jīng)處

理而直接測定。

(二)茚三酮比色法

1．原理

氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)），

可用吸光光度法測定。

該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為 570nm，故據(jù)此

可以測定樣品中氨基酸含量。

2．操作方法

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確吸取 200μg /mL 的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相當(dāng)于

0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分別置于25mL 容量瓶或比色管中，各加

水補(bǔ)充至容積為4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸鹽緩沖溶液（pH 為8.04）各

1mL，混合均勻，于水浴上加熱15min，取出迅速冷至室溫，加水至標(biāo)線，搖勻。靜置15min

后，在570nm 波長下，以試劑空白為參比液測定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克

數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)樣品測定

吸取澄清的樣品溶液 1～4mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，在相同條件下測定吸光度A 值，

用測得的A 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查得對應(yīng)的氨基酸微克數(shù)。

3．結(jié)果計(jì)算

氨基酸含量（mg/100g）=

式中：c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的氨基酸的質(zhì)量數(shù)，μg；

m——測定的樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g。

4．說明及注意事項(xiàng)

①通常采用的樣品處理方法為：準(zhǔn)確稱取粉碎樣品 5～10g 或吸取樣液樣品5～10mL，

置于燒杯中，加入50mL 蒸餾水和5g 左右活性炭，加熱煮沸，過濾，用30～40mL 熱水洗

滌活性炭，收集濾液于100mL 容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻備測。

②茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進(jìn)行

純化，具體操作可參閱黃偉坤等編著《食品檢驗(yàn)與分析》。

(三)非水溶液滴定法

1．原理

氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其含量。根據(jù)酸

堿的質(zhì)子學(xué)說：一切能給出質(zhì)子的物質(zhì)為酸，能接受質(zhì)子的物質(zhì)為堿；弱堿在酸性溶劑中堿

性顯得更強(qiáng)，而弱酸在堿性溶劑中酸性顯得更強(qiáng)，因此本來在水溶液中不能滴定的弱堿或弱

酸，如果選擇適當(dāng)?shù)娜軇┦蛊鋸?qiáng)度增加，則可以順利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中

呈現(xiàn)中性，而在冰醋酸中就能接受質(zhì)子顯示出堿性，因此可以用高氯酸等強(qiáng)酸進(jìn)行滴定。

本法適合于氨基酸成品的含量測定。允許測定的范圍是幾十毫克的氨基酸

2．測定

(1)直接法（適用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品50mg 左右，溶解

于20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示劑，用0.100mol/L 高氯酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定（用10mL 體積

的微量滴定管），終點(diǎn)為紫色剛消失，呈現(xiàn)藍(lán)色?？瞻坠転椴缓被岬谋姿嵋?，滴定至

同樣終點(diǎn)顏色。

(2)回滴法（適用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣

品30～40mg 左右，溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加2 滴甲基紫指示劑，剩余的

酸以醋酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經(jīng)過綠、藍(lán)至初次出現(xiàn)不褪的紫色為終點(diǎn)。

3．說明

(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法測定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、組

氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸。不易溶解于冰

醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法測定的有：賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。

(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將樣品溶解于2mL 甲酸中，再

加20mL 冰醋酸，直接用標(biāo)準(zhǔn)的高氯酸溶液滴定。

(四)鄰苯二甲醛法(OPT 法)

1．原理

鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，于堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適

的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為340 和455nm?？赡墚a(chǎn)物為：

各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同，其相對熒光強(qiáng)度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，

異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨

酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。

本法可用于測定游離氨基酸的含量。靈敏度較茚三酮法約高 100 倍以上，可測到0.1～

1×10－4mol 氨基酸。如用于血清中α-氨基氮的測定，每次血清用量只需5～10μL。與另一

種熒光試劑（螢光胺）一樣，空白無熒光，只有與氨基酸結(jié)合才產(chǎn)生熒光。缺點(diǎn)是與脯氨酸

不產(chǎn)生熒光，鄰苯二甲醛與半胱氨酸熒光值太低。熒光胺已有用于氨基酸自動分析定量分析，

但由于試劑昂貴及個(gè)別氨基酸反應(yīng)不滿意，目前還未普遍應(yīng)用。

(五)三硝基苯磺酸法

三硝基苯磺酸（TNBS）是定量測定氨基酸的重要試劑之一。TNBS 在偏堿性的條件下

與氨基酸反應(yīng)，先形成中間絡(luò)合物，如下式所示：

中間絡(luò)合物在光譜上有二個(gè)吸收值相近的高峰，分別位于355nm 和420nm 附近。然

而溶液一旦酸化，中間絡(luò)合物轉(zhuǎn)化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 處的吸收值

顯著下降，而350nm 附近的吸收峰則移至340nm 處。

利用 TNBS 與氨基酸反應(yīng)的這一特性，可在420nm 處（偏堿性溶液中）或在340nm

（偏酸性溶液中）對氨基酸進(jìn)行定量測定。下表列出各種氨基酸與TNBS 反應(yīng)后在不同條

件下測定的吸光度。在340nm 處，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 處的吸光度

因氨基酸種類而異；在加入適量SO3

2－時(shí)，吸收值升高。

本法允許的測定范圍是 0.05～0.4μmol 氨基酸。

表 10-3 各種氨基酸與TNBS 反應(yīng)后在不同條件下測定的吸光度

氨基酸種類 堿性溶液① 酸性溶液加 SO3

①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，于40℃反應(yīng)2h，用水補(bǔ)充至4mL，

在420nm 處測定。制作氨基酸濃度—吸光度坐標(biāo)圖，從曲線中求得各氨基酸于1μmol 時(shí)的吸光度。

②條件同上，但在與TNBS 反應(yīng)時(shí)加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最后總體積也是4mL，同樣在420nm 處

測定。

③條件同①，但與 TNBS 反應(yīng)后加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 處測定。

(六)乙酰丙酮和甲醛熒光法

1．原理

氨基酸與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙?；?,4-二氫吡啶，

產(chǎn)生黃-綠色熒光，可用熒光分析法檢測。主要反應(yīng)如下：

乙酰丙酮 甲醛 氨基酸 熒光物質(zhì)

2．試劑

混合試劑：取1mol/L 乙酸鈉溶液10mL，加入乙酰丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，

用水稀釋至30mL。

3．測定

取氨基酸液 1mL，加入混合試劑1mL，用棉花塞滿試管口，避光于100℃下加熱10min，

冷卻，加水2mL，然后測定熒光值。

表 10-4 各種氨基酸的發(fā)射波長和檢測范圍

化合物（激發(fā)波長405nm） 發(fā)射波長（nm） 檢測范圍（mg/L）

甘氨酸 485 2～10

苯丙氨酸 490 8～40

絲氨酸 485 5～25

半胱氨酸（鹽酸鹽） 500 20～100

谷氨酸 485 20～100

與標(biāo)準(zhǔn)相比較求出樣品中的氨基酸含量。

二、個(gè)別氨基酸的定量測定

（一）賴氨酸的測定

1．原理

用銅離子阻礙游離氨基酸的α-氨基,使賴氨酸的ε-氨基可以自由地與1-氟-2,4 二硝基

苯(FDNB)反應(yīng),生成ε-DNP-賴氨酸。經(jīng)酸化和用二乙基醚提取,在波長390nm 處有吸收峰,

從而求出樣品中游離賴氨酸的含量.

2．試劑

(1)氯化銅液：稱28.0g 無水氯化銅，用水稀釋至1000mL。

(2)磷酸三鈉溶液：稱68.5g 無水磷酸鈉,用水稀釋至1000mL。

(3)硼酸鹽緩沖液（pH9.1～9.2）：稱54.64g 帶有10 結(jié)晶水的四硼酸鈉，用水稀釋至

1000mL 。

(4)磷酸銅懸浮液：攪拌情況下，把氯化銅液200mL，緩慢倒入400 mL 的磷酸三鈉溶液

中，把懸浮液以2000r/min 速度離心5min ，用硼酸鹽緩沖液再懸浮沉淀物，洗滌離心3 次，

把最后的沉淀物懸浮在硼酸鹽緩沖液中，并用緩沖液稀釋至1L。

(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀釋至100mL。

(6)賴氨酸-HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取一定量賴氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作標(biāo)準(zhǔn)液。

(7)100g/L 丙氨酸溶液。

3．測定

(1)稱取通過40 目篩的均勻試樣1.00g，置于100mL 燒瓶中。另吸取賴氨酸-HCl 標(biāo)準(zhǔn)工

作液5mL（相當(dāng)1mg 賴氨酸-HCl），連同試劑空白同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

(2)向各燒瓶中加入25mL 磷酸銅懸浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振搖15min。吸

取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各處理燒瓶中,將燒瓶置沸水中加熱15min。

(3)取出燒瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不斷搖動使之酸化和分散均勻。

(4)燒瓶中的溶液冷卻至室溫,用水稀釋至100mL.取約40mL 懸浮液進(jìn)行離心。

(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。并將溶液收集于有刻度試管中,于65℃

水浴中加熱15min，以除去殘留的醚。并記錄溶液的毫升數(shù)。

(6)吸取上述各處理液10mL，分別與95%乙醇溶液10mL 混合，用濾紙過濾。

(7)用試劑空白液凋零，測定樣液A390nm，與賴氨酸-HCl 標(biāo)準(zhǔn)液對照，求出樣品中賴氨

酸-HCl 的含量。

本法在 0～40mg/L 賴氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

4．說明

(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸的濃度，有助于賴氨酸-HCl 濃度

具有良好的線性關(guān)系。

(2)用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDWB

的產(chǎn)物破壞，否則這些產(chǎn)物在390nm 處存在干擾。

（二）色氨酸的測定

1.原理

樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生

成哈爾滿化合物（norharman），具有特征熒光值，可以進(jìn)行定量測定。

2．試劑

(1)0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸溶液：稱取三氯化鐵(FeCl3?6H2O)41mg，加入10%三

氯乙酸溶液溶解并定溶至500mL。

(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。

(3)色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,

置棕色瓶中備用,使用時(shí)用水稀釋成1mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

3．測定

稱取樣品粉末 100～200mg 于離心管中，加入4mL 乙醚,搖勻后過夜，以3000r/min 速

度離心。將乙醚提取液移入試管內(nèi),并用乙醚洗滌殘?jiān)? 次，收集乙醚液于試管中，于40℃

水浴除去醚。殘留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，于110℃水解16～24h。水

解液用4mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)至pH6～8 后,用水定容至50mL,過濾備用。

吸取濾液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸混合液2mL，

搖勻后于100℃水浴中加熱1h，取出，冷卻后用水定容至10mL。在激發(fā)波長為365nm，發(fā)

射波長449nm 條件下，測定樣品的熒光強(qiáng)度，與色氨酸標(biāo)樣作對照，求出樣品中色氨酸含

量。

本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

為什么氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液中只有17種氨基酸？

氨基酸，是羧酸碳原子上的氫原子被氨基取代后的化合物，氨基酸分子中含有氨基和羧基兩種官能團(tuán)。與羥基酸類似，氨基酸可按照氨基連在碳鏈上的不同位置而分為α-，β-，γ-…w-氨基酸，但經(jīng)蛋白質(zhì)水解后得到的氨基酸都是α-氨基酸，而且僅有二十幾種，他們是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位。

氨基酸溶液如何配制？

去離子水+濃度

4攝氏度下保存可以一周左右

-70℃可以保存1年以上

配制氨基酸態(tài)氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05mol

1、要給出具體的氨基酸，即可得到其摩爾質(zhì)量M；

2、配制標(biāo)準(zhǔn)溶液要給出配制的濃度（例如：c=0.05mol/L）和體積(例如：v=1000ml)；

3、計(jì)算稱量氨基酸的質(zhì)量 m = cvM ;

4、 在小燒杯里同分析天平稱量氨基酸的質(zhì)量數(shù)，溶樣后定量轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，定容。

5、轉(zhuǎn)移到試劑瓶中，貼標(biāo)簽。

求助 在用茚三酮法做氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí) 為什么沒有顏色呢？或者顏色非常淺。。。

可能原因：

1、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸含量太低

2、反應(yīng)溫度未達(dá)到

3、反應(yīng)后未及時(shí)測量，擱置太久

1 茚三酮配制：稱0.6g茚三酮，加入15毫升正丙醇，溶解。再加入30毫升正丁醇，60毫升乙二醇，最后加入PH5。4的乙醇-乙酸鈉緩沖液9毫升，混勻，4攝氏度棕色試劑瓶保存，可保存十天。

2 PH5。4的乙醇-乙酸鈉緩沖液：54。4克乙酸鈉加入100毫升無氨蒸餾水，加熱至沸騰，使體積蒸發(fā)至60毫升左右。冷卻，加入30毫升冰醋酸，用無氨蒸餾水定容至100毫升。

3 氨基酸標(biāo)液：稱80攝氏度烘干的亮氨酸46。8毫克，用10%異丙醇定容至100毫升，為1毫摩爾/升的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸儲備液，冰箱保存。從中取5毫升，蒸餾水定容至50毫升，為5微克/毫升氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液。

4 氰化鈉儲備液：稱取490毫克，溶于一升無氨蒸餾水，為0。01摩爾/升。

5 10%乙酸

6乙酸-氰酸鹽緩沖液：0。01摩爾/升氰化鈉20毫升，用乙醇-乙酸鈉緩沖液定容至一升。

7標(biāo)線

管號 1 2 3 4 5 6

氨基液標(biāo)液（毫升）0 0。2 0。4 0。6 0。8 1

無氨蒸餾水（毫升）2 1。8 1。6 1。4 1。2 1

茚三酮（毫升） 3 3 3 3 3 3

乙酸-氰酸鹽緩沖液 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5

每管游離氨基酸含量（微克）

0 1 2 3 4 5

加完試劑后，沸水中加熱15分鐘，取后后迅速冷卻，并不時(shí)搖動，呈現(xiàn)藍(lán)紫色時(shí)，用60%乙醇定容至20毫升。搖勻，570納米測定吸光度。

計(jì)算：

含量（微克/100克）=C*VT*100/（VS*W）

C：從標(biāo)線上查得的含量 微克

VT：樣品總體積 毫升

VS：測定時(shí)取用的樣品體積 毫升

W：樣品鮮重 克